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    • 专利摘要:

    公开号:WO1989009280A1
    申请号:PCT/DE1989/000206
    申请日:1989-03-31
    公开日:1989-10-05
    发明作者:Herbert Stadler；Bernd Schmidt
    申请人:Biometra Biomedizinische Analytik Gmbh；
    IPC主号:C12Q1-00
    专利说明:
    [0001] Verfahren zum Nachweis von Verbindungen, die katalysiert durch Oxidase Elektronen aufnehmen oder abgeben können
    [0002] B e s c h r e i b u n g
    [0003] Technisches Gebiet
    [0004] Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum kontinuierlichen Nachweis von Verbindungen, die katalysiert durch Enzyme Elektronen aufnehmen oder abgeben können, sowie eine hierzu geeignete Anordnung.
    [0005] Stand der Technik
    [0006] Viele auf biologischem Wege erhaltenen Lebens- und Genußmittel werden durch Fermentation organischer Verbindungen gewonnen. Dazu läßt man in Bioreaktoren organisches Material und geeignete Mikroorganismen in sauerstoffarmem bzw. sauerstoffreiem Milieu zur Gärung kommen unter Entstehung des gewünschten Produkts . Beispiele hierfür sind die Herstellung von Bier, Wein oder industriell erzeugten Alkoholen. Hier ist es bei der Herstellung sehr wünschenswert, durch kontinuierliche Bestimmung der Konzentration einer Verbindung als Parameter den Gärungsprozeß zu überwachen. Ebenso ist es in der Fruchtsaftindustrie erforderlich, unmittelbar und ohne zeitliche Verzögerung über den gesamten Produktionsverlauf hinweg die Bildung von Alkohol, die unerwünscht ist, zu kontrollieren.
    [0007] Bisher wurde die Überwachung des Gärungs- bzw. Herstellungsprozesses so durchgeführt, daß in bestimmten Abständen Probelösungen abgenommen wurden, in denen dann Parameter, wie Glucose, gebildetes Ethanol usw., bestimmt wurden. Hierzu geeignet sind beispielsweise sogenannte Biosensoren. Diese Biosensoren sind so aufgebaut, daß auf einer Elektrode eine Membran aufgebracht ist, auf der wiederum ein Enzym das eine Reaktion katalysiert, die zu einer durch die Elektrode nachweisbaren Substanz führt, in immobilisierter oder gelöster Form vorhanden ist. Die zu bestimmende Probelösung wird mit dem Enzym in Kontakt gebracht, und die gebildete Substanz, wie beispielsweise Wasserstoffperoxid, diffundiert langsam durch die Membran zur Elektrode, über die dann die Messung erfolgt.
    [0008] Nachteil dieses bekannten Verfahrens ist es, daß nur diskontinuierliche Messungen durchgeführt werden können. Weiterhin können die bekannten Biosensoren nur als Eintauchelektroden eingesetzt werden. Sie verschlammen daher schnell und sind allgemein sehr anfällig und müssen nach kurzer Zeit ersetzt werden. Da das Bestimmungsverfahren mit einem derartigen Biosensor nicht kontinuierlich durchgeführt werden kann, ist die Überwachung der Lösung nicht autcmatisierbar.
    [0009] Darstellung der Erfindung
    [0010] Es war nun Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zu schaffen, mit dem kontinuierlich in einfacher Weise ein Parameter bestimmt werden kann. Weiterhin war es Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, daß automatisierbar ist und für die direkte "on line"-Analytik einsetzbar ist.
    [0011] Weiterhin soll eine Vorrichtung geschaffen werden, die zum kontinuierlichen Nachweis von Verbindungen geeignet ist und die durch einfache Maßnahmen für die Bestimmung verschiedener Substanzen angepaßt werden kann. Außerdem soll eine Vorrichtung zur Verfügung gestellt werden, bei der der Anteil mit der geringsten Lebensdauer, das am Trägermaterial immobilisierte Enzym, leicht ersetzt werden kann, ohne daß die gesamte Vorrichtung ausgewechselt werden müßte. Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum kontinuierlichen Nachweis von Verbindungen, die katalysiert durch Oxidasen Elektronen aufnehmen oder abgeben können, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man kontinuierlich einer Fermentationslösung eine Probenlösung entnimmt, über einen Filter und dann über eine Trägersubstanz, an der Oxidasen und gegebenenfalls weitere Enzyme immobilisiert sind und die sich in einer Minisäule befindet, leitet und anschließend in der die Minisäule verlassenden Lösung gebildetes H2O2 durch elektrochemische Detektion quantitativ bestimmt.
    [0012] überraschenderweise gelingt es mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, in einfacher Weise kontinuierlich Verbindungen, die katalysiert durch Oxidase Elektronen aufnehmen oder abgeben können, direkt und ohne Zeitverzögerung nachzuweisen. Da das in der Minisäule gebildete H2O2 gelöst in dem Eluat den Detektor durchströmt, erfolgt die Bestimmung rasch und quantitativ. Aufgrund des vorgeschalteten Filters tritt eine Verschlammung des Systems nicht auf.
    [0013] Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich, die nachzuweisende Substanz bis zu einer Konzentration von 0,1 nmol nachzuweisen.
    [0014] Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird einer Fermentationsflüssigkeit kontinuierlich während des Produktionsprozesses Flüssigkeit entnommen und zuerst über ein Filter geleitet, wobei grobe Verunreinigungen zurückgehalten werden. Die so mechanisch gereinigte Flüssigkeit wird dann in eine Minisäule, die eine Größe von etwa 2 bis 8 x 0,05 bis 0,1 cm haben kann, geleitet. Diese Minisäule ist mit einer Trägersubstanz gepackt, an der Enzyme immobilisiert sind. In erster Linie ist an diese Trägersubstanz eine Oxidase gekuppelt. Weiterhin können noch andere Enzyme gebunden sein, die die zu bestimmende Substanz in eine gewünschte Reaktionsform umsetzen, beispielsweise also Ester spalten. Die Bindung des Enzyms an die Trägersubstanz erfolgt in an sich bekannter Weise. Als Trägersubstanz können die an sich für diese Zwecke bekannten Substanzen verwendet werden. Geeignet sind beispielsweise Agarose oder Dextrane sowie Acryl- und Methacrylsäurepolymerisate. Die Immobilisierung des Enzyms an dem Trägermaterial erfolgt besonders bevorzugt, wie es in US-PS 4,177,033 beschrieben ist.
    [0015] Die verwendete Oxidase richtet sich nach der Verbindung, die nachgewiesen werden soll. Als geeignete Enzyme sind die Oxidasen zu nennen, die die Oxidation von Glucose,
    [0016] Galactose, Pyruvat, Lactat, Methanol, Ethanol, Propanol und Aldehyden katalysieren. Bevorzugt wird Gluccseoxidase, Pyruvatoxidase, Ethanoloxidase und Lactatcxidase verwendet.
    [0017] Durch das Leiten der Flüssigkeit über die in einer Minisäule vorliegenden immobilisierten Enzyme erfolgt die gewünschte Reaktion der zu bestizimenden Substanz unter Entstehung von Wasserstoffperoxid. Das in der die Minisäule verlassenden Lösung enthaltene Wasserstoffperoxid ist daher ein direktes Maß für die Menge an umgesetzter Substanz.
    [0018] In der aus der Minisäule ausfließenden Lösung wird dann der Wasserstoffperoxidgehalt in an sich bekannter Weise durch elektrochemische Detektion quantitativ bestimmt. Hier sind die an sich bekannten elektrochemischen Verfahren geeignet. Besonders bevorzugt wird das entstehende H2O2 mit einem elektrochemischen Detektor, der mit Platinelektroden und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode ausgestattet ist, nachgewiesen. Bevorzugt erfolgt die Bestimmung mit der Elektrode dabei in einer Durchflußküvette. Vor der Einführung der Lösung in die Minisäule kann die Flüssigkeit noch durch Zuführung eines Puffers verdünnt werden. Abhängig von der in der Lösung vorliegenden Konzentration der zu bestimmenden Substanz kann die geeignete Verdünnung leicht bestimmt werden. So sind im Fall des Nachweises von Glucose Konzentrationen der Lösung im Bereich von 2g/l oder weniger geeignet, und die Verdünnung der Lösung sollte bei einer höheren Glucosekonzentration entsprechend mit Pufferlösung vorgenommen werden.
    [0019] In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann Glucose in einer aus einem Fermenteransatz kontinuierlich entnommenen Lösung nachgewiesen werden. Dazu wird an dem Trägermaterial Glucoseoxidase immobilisiert. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform wird verwendet zum Nachweis von Methanol, Ethanol oder Propanol in einer Fermentationsflüssigkeit, wobei als immobilisiertes Enzym Alkoholoxidase gebunden wird, das die Oxidation des entsprechenden Alkohols unter Entstehung von Wasserstoffperoxid katalysiert.
    [0020] In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Sacharose nachgewiesen. Dazu wird an dem Trägermaterial zusätzlich zu Glucoseoxicase das Enzym Invertase immobilisiert, das die Sacharose in Glucose und Fructose spaltet. Die dabei entstehende Glucose wird dann, katalysiert durch Glucoseoxicase, unter Bildung von Wasserstoffperoxid umgesetzt.
    [0021] Ein Vorteil des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, daß es sehr einfach durchgeführt werden kann. Die Biomasse kann entweder unverändert oder nach Verdünnung mit einem Puffer in die Minisäule und von dort unverändert zu dem elektrochemischen Detektionssystem geleitet werden, überraschenderweise können mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Substanzen auch nach mehrtägigem kontinuierlichem Durchströmen mit Biomassen verschiedenster Art nachgewiesen werden, da die immobilisierten Enzyme auch über einen längeren Zeitraum aktiv bleiben und nicht abgelöst werden. Es ist daher möglich, Substanzen schnell und kontinuierlich über einen langen Zeitraum spezifisch und empfindlich nachzuweisen.
    [0022] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist eine Anordnung zur Überwachung eines in einem Bioreaktor, insbesondere einem Fermentationsbehälter, ablaufenden biochemischen Prozesses mittels eines elektrochemischen Detektors, der auf H2O2 anspricht, die dadurch gekennzeichnet ist, daß die Probelösung in einem kontinuierlichen Weg aus dem. Bioreaktor über ein Filter und eine dem Filter nachgeschaltete Minisäuie mit an einer Trägersubstanz immobilisierten Oxidasen und gegebenenfalls immobilisierten weiteren Enzymen dem elektrochemischen Detektor zuführbar ist.
    [0023] Diese erfindungsgemäße Anordnung ist sehr gut zum Nachweis von Parametern, die eine Überwachung des biologisch ablaufenden Prozesses in einem Bioreaktor erlauben, geeignet. Insbesondere kann diese Anordnung mit einem Steuerelement verbunden werden, das wiederum aufgrund der erhaltenen Ergebnisse die Bedingungen in dem Bioreaktor steuert.
    [0024] Die erfindungsgemäße Anordnung weist eine Minisäule auf, die die immobilisierten Oxidasen und gegebenenfalls weitere Enzyme, die für den Nachweis eines Parameters vorhanden sein müssen, enthält. Die Enzyme sind in an sich bekannter Weise an ein Trägermaterial gebunden. Der Minisäule wird die Probelösung aus dem Bioreaktor zugeführt, wobei sich zwischen Bioreaktor und Minisäule ein Filter befindet, der Zellteile und Verunreinigungen aus der Probelösung entfernt. Die Probelösung durchläuft die Minisäule, wobei durch die Anwesenheit der Enzyme die nachzuweisende Verbindung umgesetzt wird unter Ent stehung von H2O2 Die Probelösung, die die Reaktionsprodukte der durch das Enzym katalysierten Reaktion enthält, verläßt die Minisäule und wird zu dem elektrochemischen Detektor geleitet. Der elektrochemische Detektor ist bevorzugt als Durchflußzelle ausgebildet. Nach Durchlaufen des elektrochemischen Detektionssystems kann die Probelösung verworfen werden.
    [0025] Die erfindungsgemäße Anordnung zeichnet sich dadurch aus, daß sie die Bestimmung verschiedenster Substanzen in sehr einfacher Weise erlaubt. Insbesondere läßt sich das Trägermaterial, das die Oxidasen und gegebenenfalls weitere Enzyme trägt, sehr leicht austauschen. So kann einerseits die Anordnung in einfacher Weise so variiert werden, daß nacheinander der Nachweis verschiedener Substanzen möglich ist, und andererseits kann der Anteil mit der geringsten Lebensdauer leicht ausgetauscht werden, ohne daß größere Eingriffe notwendig sind. Die erfindungsgemäße Anordnung ist geeignet, als Steuereinrichtung in einem Fermentationsverfahren eingesetzt zu werden. Dazu enthält sie noch zusätzlich Steuerelemente, die aufgrund der bei der Detektion erhaltenen Ergebnisse die Zugabe von Substanzen zur Fermentationsfiüssigkeit oder die Änderung der Fermentationsbedingungen steuert.
    [0026] Kurze Beschreibung der Zeichnung
    [0027] Die Erfindung wird durch die Figur und die folgenden Beispiele erläutert.
    [0028] Fig. 1 zeigt eine Schemazeichnung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Beschreibung eines Ausführungsbeispiels
    [0029] Die Figur zeigt einen Fermentationsbehälter 1 zur Durchführung eines biochemischen Prozesses. Aus diesem Fermentationsbehälter 1 wird kontinuierlich über die Leitung 2 Probelösung entnommen. Die Probelösung wird über ein Filter 4 in die Minisäule 6 geleitet. In der Minisäule 6 befindet sich ein Trägermaterial 8, an das Glucoseoxidase gebunden ist. Die Probelösung verläßt die Minisäule über die Leitung 10 und wird zu einer Durchflußküvette 12 geleitet, die zur Detektion mit Platinelektroden und einer Ag/AgCl-Referenzelektrode ausgestattet ist. Die aus der Durchflußküvette 12 fließende Lösung wird dann in einem Sammelbehälter 14 aufgefangen.
    [0030] B e i s p i e l 1
    [0031] Es wurden Standardlösungen bekannter Glucosekonzentrationen wöchentlich frisch hergestellt und bei -20 °C eingefroren und direkt vor Gebrauch jeweils aufgetaut. Mit diesen Standardlösungen wurde vor Beginn der Messung die Meßapparatur geeicht.
    [0032] In einem Fermenteransatz wurde E.coli bei 37 °C mit einer Startkonzentration von 40 g Glucose/l in Bactotrypton-Medium unter Sterilbedingungen angezogen, über einen Zeitverlauf von 24 h wurde kontinuierlich Biomasse in einer Menge von 0,1 ml/min entnommen. Die Biomasse wurde nach Austritt aus dem Fermenter filtriert, um gröbere Partikel oder Zellen zu entfernen. Das Filtrat wurde dann in einer Mischkammer im Verhältnis 1:20 mit 50 mM Natriumphosphatpuffer mit einem pH von 7,5 verdünnt. Der Puffer wurde mit einer Pumpe der Mischkammer zugeführt. Das so erhaltene verdünnte Filtrat wurde dann in eine Minisäule (4 x 0,2 cm) geleitet. Die Minisäule enthielt an Agarose immobilisierte Glucoseoxidase. Dazu wurden 1000 Einheiten Glucoseoxidase aus Aspergillus niger an 1 ml vorgequollene, aktivierte Agarose kovalent gebunden. Ein Teil der Aufschlämmung wurde dreimal mit dem Elutionspuffer gewaschen und dann in eine mit dem elektronischen Detektor verbundene Minisäule, aus Edelstahl (4 x 0,2 cm, Volumen 125 ul) mit einem Edelstahlfilter, die in einen Standard-HPLC-Vorsäulenhalter eingeschraubt war, eingebracht.
    [0033] Als elektronischer Detektor wurden eine Platinelektrode und eine Ag/AgCl-Referenzelektrcde verwendet. Der Detektor wurde bei 500 mV betrieben.
    [0034] Die im Zeitraum von 24 h erhaltenen Ergebnisse wurden verglichen mit Ergebnissen, die mit Giucoseεichlcsungen erhalten wurden. Dabei ergaben die Auswertungen, daß die für die Eichlösungen erhaltenen Werte zu 3eginn und nach 24 h praktisch identisch waren. Der in der Biomasse nach 24 h bestimmte Wert war 4 g Glucose/l. Unabhängig von der Messung wurde in der Biomasse die Giucosekonzentration mit der klassichen enzymatischen Methode spektrophotometrisch bestimmt. Er betrug ebenfalls 4 g Glucose/l.
    权利要求:
    ClaimsP a t e n t a n s p r ü c h e
    1. Verfahren zum kontinuierlichen Nachweis von Verbindungen, die katalysiert durch Oxidasen Elektronen auf nehmen oder abgeben können, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß man kontinuierlich einer Fermentationslösung eine Probenlösung entnimmt, über einen Filter und dann über eine Trägersubstanz, an der Oxidasen und gegebenenfalls weitere Enzyme immobilisiert sind und die sich in einer Minisäule befindet, leitet und anschließend in der die Minisäule verlassenden Lösung gebildetes H2O2 durch elektrochemische Detektion quantitativ bestimmt.
    2. Verfahren nach Anspruch 1, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß als Oxidase Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Pyruvatoxidase oder Ethanoloxidase verwendet wird.
    3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Fermentationslösung Bier, Wein oder Fruchtsaft ist.
    4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die zu bestimmende Verbindung Glucose, Fructose, Lactat, Pyruvat oder Ethanol ist.
    5. Anordnung zur Überwachung eines in einem Bioreaktor, insbesondere einem Fermentationsbehälter ablaufenden biochemischen Prozesses mittels eines elektrochemischen Detektors, der auf H2O2 anspricht, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß eine Probelösung in einem kontinuierlichen Weg aus dem Bioreaktor über einen Filter und eine dem Filter nachgeschaltete Minisäule mit an einer Trägersubstanz immobilisierten Oxidasen und gegebenenfalls immobilisierten weiteren Enzymen dem elektrochemischen Detektor zuführbar ist.
    6. Anordnung nach Anspruch 5, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß der elektrochemische Detektor als Durchflußzelle ausgebildet ist.
    7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, d a d u r c h g e k e n n z e i c h n e t , daß die Oxidase Glucoseoxidase, Lactatoxidase, Pyruvatoxidase oder Ethanoloxidase ist.
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    同族专利:
    公开号 | 公开日
    DE3811099A1|1989-10-12|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    法律状态:
    1989-10-05| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): JP US |
    1989-10-05| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE CH DE FR GB IT LU NL SE |
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
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